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甜瓜CBL基因的鉴定和特征分析

发布时间:[2019-4-4 8:41:33]    浏览量:61次
甜瓜CBL基因的鉴定和特征分析 
刘明毓1,纪复勤2,马强1,胡向树1,李利斌3,董玉梅3
1山东省东平县种子公司,山东东平,271500
2山东省宁阳县万丰种业有限公司, 山东宁阳,271400

3 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心,山东济南,250100

  摘要:CBL 基因在植物逆境应答和生长发育中具有重要功能,但在甜瓜中尚未见报道。本文利用比较基因组学的方法,从甜瓜基因组中鉴定出7个CBL基因,并对它们的基因组分布、基因结构、系统进化和顺式调控元件进行了分析。结果显示,它们分布在不同的染色体上,都含有8个外显子,编码区在642-738bp,编码的蛋白都含有3个结合钙离子的EF手结构和能够与CIPK互作的FPSF位点。而且,在它们的上游基因序列中存在多个环境应答元件,且各不相同,暗示它们可能具有多种生物学功能。本文为进一步研究甜瓜CBL的功能奠定了基础。
关键词:甜瓜;CBL; 结构;进化;顺式元件
Identification and characterization of CBL genes in melon
Liu Mingyu1, Ji Fuqin2, Ma Qiang1, Hu Xiangshu1,李利斌3,董玉梅3§ 
1 Dongping County Seeds Limited Cooperation of Shandong Province, Dongping County of Shandong Province, 271500
2 Ningyang Wanfeng Seeds Limited Cooperation of Shandong Province, Ningyang County of Shandong Province, 271400
3 Vegetable and Flower Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences;Key Laboratory of Greenhouse Vegetables Biology of The Shandong Province;National Improvement Center for Vegetables, Shandong Branch,Jinan, 250100
Abstract  Plant CBL genes have very important roles in response to environmental stress and development. However,there is no investigation report about them in melon at pesent. In this paper, 7 CBL genes in melon genome were identified and their genome distribution, gene structure, phylogeny and cis-elements were systematically analyzed. The results showed that all these genes distribute on different chromosomes respectively, and all of them have 8 exons. And their conding seuquence length is from 642bp to 738bp.There are 3 EF- hands that can bind calcium ions, and  FPSF motif which interacts which CIPK kinases. What’s more, there are different cis-elements responsive to multiple hormones and stimuli in their upstream sequences, which suggests they have multiple biological roles. This text will lay the foundation for further functional elucidation of these genes in melon.
Key words: Cucumis melo L.; CBL; structure; phylogeny; cis-element
  作者简介:刘明毓,女,农艺师,主要从事作物育种和种子生产检测。电话:0538-2821990
E-mail: 503541083@qq.com.

  为通讯作者。董玉梅,女,博士,研究员,主要从事西瓜和甜瓜遗传育种研究。E-mail:dongyumeijn@163.com。
  基金项目:山东省蔬菜良种工程项目;山东省农业重大应用技术创新项目“设施西瓜、甜瓜优质安全高效生产关键技术研究与示范” 。

  植物中一类与钙结合的CBL蛋白(类钙调磷酸酶B亚基蛋白,Calcineurin-B like protein)能够感受钙信号,在植物非生物逆境应答和矿质营养吸收、ABA信号转导过程中具有重要功能[1,2]。CBL主要是通过和一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(CIPK)互作来调控下游基因的表达,以响应各种不同的逆境信号,而且这一信号系统在植物界广泛存在[2,3]。目前有关植物CBL 的研究日益受到关注,从模式植物拟南芥和水稻不断向其他作物扩展[4-10],其中以拟南芥CBL的研究最为深入。拟南芥CBL1和CBL9可以与CIPK23结合,调控下游基因AKT1的表达,从而促进钾离子的吸收[11];CBL1还参与了ABA的信号转导、冷胁迫应答过程以及植物对葡萄糖和赤霉素的响应[12,13]; CBL2和CBL3能够调控植物生长、种子大小和胚胎发育[14,15]; CBL4/SOS3和CBL10蛋白可以和CIPK24(SOS2)结合,调控下游基因SOS1(钠离子/质子-反向运输载体)的表达,促进细胞中钠离子的排出,从而提高植物对盐胁迫的抗性[16,17];拟南芥CBL5过表达可以提高植物的抗旱能力[18];CBL9还可调控ABA的合成及应答反应[19]。最近报道拟南芥的CBL2 和CBL3在高镁胁迫应答中具有重要功能[20]。
  甜瓜作为重要的蔬菜作物,其非生物逆境抗性对于生产具有重要意义。但有关甜瓜CBL的研究尚未见报道。本文利用生物信息学的方法从甜瓜基因组中鉴定出7个CBL基因,并对这些基因的染色体分布、分子特征、遗传进化及顺式调控元件进行了分析,为进一步研究这些基因在甜瓜逆境应答中的功能奠定了基础。
  1研究方法
  利用拟南芥的CBL 基因序列在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索比对甜瓜的基因组序列,寻找甜瓜的CBL基因序列,对鉴定出的CBL基因进行结构分析和遗传进化分析,并对它们启动子序列中的顺式元件进行预测。结构分析利用GSDS( http: / /gsds. cbi. pku. edu. cn /) 在线进行,遗传进化分析利用MEGA4. 1 进行,采用Bootstrap test -Neighbor Joining 方法,重复1000 次运算。蛋白序列比对采用DNAMAN方法,顺式元件预测采用PlantCARE 软件进行在线分析。亚细胞定位预测在WoLF PSORT( http://wolfpsort.
org/)中进行。蛋白基序分析用Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/ motif_ scan)在线进行。
  2 结果与分析
  2.1 甜瓜CBL基因的鉴定和特征分析 
  笔者从甜瓜基因组中鉴定出7个CBL基因(表1),分别命名为 CmCBL1到 CmCBL7。它们在基因组中的分布是不均匀的,其中,CmCBL1位于3号染色体,CmCBL2位于4号染色体,
  CmCBL7位于8号染色体,其余四个基因都位于6号染色体。结构分析显示,它们都含有8个外显子。编码区序列大小是600~750bp,差异不大,但是基因组序列大小差异明显(图1)。亚细胞定位预测显示,它们编码的蛋白分别定位在细胞质、细胞核或者叶绿体中。

表1 甜瓜CBL的命名染色体分布及结构特征


  图1 甜瓜CBL基因的外显子-内含子结构 (图中方框代表外显子,方框之间的线段代表内含子)
  2.2 甜瓜CBL基因的系统进化和蛋白结构分析
  基因的遗传进化分析可为基因功能研究提供重要的线索。分析结果显示,甜瓜的CBL基因分为三类(图2):CmCBL2/3/4/6为一类;CmCBL1单独为一类;而CmCBL5/7为第三类。CmCBL1与AtCBL10直系同源,CmCBL2与AtCBL1直系同源;CmCBL3与AtCBL5直系同源;CmCBL4与AtCBL4直系同源;CmCBL5/7与AtCBL2/3直系同源;CmCBL6与AtCBL9直系同源。序列比对分析发现,甜瓜CBL蛋白含有多个保守的氨基酸残基和位点(图3),其中包括能与蛋白激酶CIPK互作的位点FPSF。蛋白基序分析发现,它们都含有3个EF手结构,1~2个磷酸化位点;多数还含有糖基化位点和豆蔻酰化位点(表2)。只有CmCBL2含有一个酰胺化位点。从结构上看,它们能与钙离子结合,且能与CIPK互作。


图2 拟南芥和甜瓜CBL的系统进化(At代表拟南芥,Cm代表甜瓜)


图 3 甜瓜CBL预测编码蛋白的序列比对
表 2 甜瓜CBL蛋白基序分析

  2.3 甜瓜CBL基因的顺式调控元件分析
  顺式调控元件在基因表达调控中具有重要功能。分析发现,在甜瓜CBL基因的上游序列中存在多个逆境和激素应答元件,且在种类和数目上各不相同(表3)。其中,CmCBL2/4/6/7 含有脱落酸应答元件ABRE, CmCBL2/3/4/5/6具有真菌激发子应答元件Box-W1;CmCBL3/6/7 具有茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif;它们都含有赤霉素应答元件GARE-motif或者p-box;CmCBL1/2/3/6/7有热胁迫应答元件HSE;CmCBL4还有一个冷胁迫应答元件LTR;CmCBL3/4/6有干旱诱导元件MBS;除CmCBL4外,还都有逆境和防卫应答元件TC-rich repeats;CmCBL2/3/4/5/6都有水杨酸应答元件;CmCBL2/3/4/6有防卫应答元件。
  表 3 甜瓜CBL基因的顺式应答元件

  注:ABRE为脱落酸应答元件;Box-W1,真菌病原物应答元件;CGTCA-motif茉莉酸甲酯应答元件;GARE-motif和p-box为赤霉素响应元件;HSE为热胁迫应答元件;LTR为冷胁迫应答元件;MBS为干旱胁响应元件;TC-rich repeats为防卫和逆境应答元件;TCA-element为水杨酸应答元件;W box为防卫应元件。
  3 结论和讨论
  本文从全基因组水平对甜瓜CBL基因进行分析,结果显示甜瓜基因组中存在7个CBL基因,分别位于不同的染色体上。它们在进化上分为三个不同的类群,在外显子数目上保守,都是8个。它们编码的蛋白都具有EF手结构、与蛋白激酶CIPK的互作位点FPSF和多个保守的氨基酸残基,可能这些位点为其行使功能所必须。在它们的上游序列中,都存在多个激素和逆境应答元件,且各不相同。它们可能不仅应答非生物逆境,而且也可应答生物逆境。在水稻和番茄中最近研究的成果也间接证实了这一点[9,21]。根据系统进化和顺式调控元件分析的结果以及拟南芥CBL研究的进展,我们认为甜瓜CBL基因具有多样的生物学功能:CmCBL1可响应赤霉素信号和热胁迫、盐胁迫及生物逆境;CmCBL2可响应ABA、赤霉素和水杨酸信号以及参与植物防卫应答反应;CmCBL3参与干旱、热以及病原物胁迫应答;CmCBL4参与ABA信号及盐、热、干旱等胁迫应答;CmCBL5/7参与种子发育和盐胁迫应答;CmCBL6参与钾离子吸收和ABA等信号应答。本文为进一步研究甜瓜CBL的功能奠定了基础。
  参考文献
[1]Kim K. Stress responses mediated by the CBL calcium sensors in plants[J]. Plant Biotechnology Reports, 2013, 7(1):1-8.
[2] Sánchez-Barrena MJ, Martínez-Ripoll M, Albert[J]  A.Structural Biology of a Major Signaling Network that Regulates Plant Abiotic Stress: The CBL-CIPK Mediated Pathway. Int J Mol Sci. 2013, 14(3):5734-49. 
[3]Kleist TJ, Spencley AL, Luan S.Comparative phylogenomics of the CBL-CIPK calcium-decoding network in the moss Physcomitrella, Arabidopsis, and other green lineages[J].Front Plant Sci. 2014,5:187.
[4] Jia Lin, LIU Yu-meng, Fan Wei,  et al. The Expression Profiling of Rice Calcineurin B-Like Proteins in Seedlings Under Environmental Stresses[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(1): 1-8. 
[5]Zhang C, Bian M, Yu H, et al. Identification of alkaline stress-responsive genes of CBL family in sweet sorghum (Sorghum bicolor L.)[J].Plant Physiol Biochem. 2011 Nov;49(11):1306-12.
[6]李利斌,刘开昌,王殿峰 等. 高粱CBL 家族基因的鉴定和初步分析[J]。山东农业科学,2009, 6: 1-5.
[7]李利斌,刘开昌,王殿峰等,玉 米CBL家族基因的生物信息学分析[J]. 玉米科学,2010, 18(1): 6-11.
[8]李利斌,王殿峰,刘立锋等. 大白菜CBL家族基因的鉴定和遗传进化分析[J]. 山东农业科学,2009,5:4-7.
[8]Zhang H, Lv F, Han X,  et al.The calcium sensor PeCBL1, interacting with PeCIPK24/25 and PeCIPK26, regulates Na(+)/K (+) homeostasis in Populus euphratica[J]. Plant Cell Rep. 2013 May;32(5):611-21
[9]de la Torre F, Gutiérrez-Beltrán E, Pareja-Jaime Y,  et al. The Tomato Calcium Sensor Cbl10 and its Interacting Protein Kinase Cipk6 Define a Signaling Pathway in Plant Immunity[J]. PlantCell, 2013, 25(7):2748-2764.
[10]Wang M, Gu D, Liu T,  et al. Overexpression of a putative maize calcineurin B-like protein in Arabidopsis confers salt tolerance[J]. Plant Molecular Biology. 2007, 65(6):733-46.
[11]Xu J, Li HD, Chen L, et al. A Protein Kinase, Interacting with Two Calcineurin B-like Proteins, Regulates K+ Transporter AKT1 in Arabidopsis[J]. Cell, 2006, 125(7): 1347-1360.
[12] Cheong Y, Kim K, Pandey G,  et al. CBL1, a Calcium Sensor That Differentially Regulates Salt, Drought, and Cold Responses in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2003, 15: 1833-1845.
[13]Li ZY, Xu ZS, Chen Y, et al.A novel role for Arabidopsis CBL1 in affecting plant responses to glucose and gibberellin during germination and seedling development[J]. PLoS One, 2013; 8(2):e56412.
[14]Tang RJ, Liu H, Yang Y, et al.Tonoplast calcium sensors CBL2 and CBL3 control plant growth and ion homeostasis through regulating V-ATPase activity in Arabidopsis[J]. Cell Research, 2012, 22(12):1650-65.
[15]Eckert C, Offenborn JN, Heinz T, et al. The vacuolar calcium sensors CBL2 and CBL3 affect seed size and embryonic development in Arabidopsis thaliana[J]. Plant J. 2014, 78(1):146-56.
[16]Ji H, Pardo JM, Batelli G,  et al. The Salt Overly Sensitive (SOS) pathway: established and emerging roles[J]. Molecular Plant. 2013, 6(2):275-86.
[17]Quan R, Lin H, Mendoza I, et al.SCABP8/CBL10, a Putative Calcium Sensor, Interacts with the Protein Kinase SOS2 to Protect Arabidopsis Shoots from Salt Stress[J]. The Plant Cell, 2007, 19: 1415-1431.
[18] Cheong Y, Sung S, Kim B, et al. Constitutive overexpression of the calcium sensor CBL5 confers osmotic or drought stress tolerance in Arabidopsis[J]. Molecules and cells, 2010, 29(2), 159-165.
[19]Pandey GK, Cheong YH, Kim KN, et al. The Calcium Sensor Calcineurin B-Like 9 Modulates Abscisic Acid Sensitivity and Biosynthesis in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 2004, 16: 1912-1924.
[20] Tang RJ, Zhao FG, Garcia VJ, et al.Tonoplast CBL-CIPK calcium signaling network regulates magnesium homeostasis in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015, 112(10):
3134-3139.
[21] 刘雨萌, 兰金苹, 曹英豪等.2012.水稻类钙调磷酸酶亚基B蛋白质在叶片生长和白叶枯病抗性反应中的表达[J].植物学报, 47 (5): 483-490.

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